ABSTRACT
Metagenomic 作用是什么
Metagenomic 的流程是什么
目前软件可以改进的地方
本文提出的MetaCoAG简述，然后方法的结果和突破。
Metagenomic 可以恢复不同物种的不同基因原料，可以给微生物社区提供有效的信息。Metagenomic bin不同组织的序列，然后将短read组装成更长的contig，然后将这些contig分类的不同的组中，代表宏基因组样本中不同的分类的组。目前的软件没有用到组装图。本文提出的MetaCoAG使用了组装图和contig的覆盖信息，用single-copy marker gene 估计初始bins的数量，迭代的将contigs分配到bin中，通过binning 过程动态调整bins的数量，比其他结果都好，而且是以第一个直接使用了组装图的方法。
INTRODUCTION
Metagenomic的背景及为什么需要
Metagenomic 目前的工具的流程
为什么 reference-free的越来越流行
reference-free的主要用的特征
目前最新的工具介绍
本文使用marker的介绍
之前工具的缺陷的点
为什么需要本文的工具
本文工具介绍
二代数据的出现，Metagenomic 的背景，直接从环境样本中测序，识别样本的组成和存在的微生物，可以用来对下游分析，为了促进这种分析，Metagenomic
在组装前 bin这些reads，因为read长度限制，所以不太可靠，因此，流行的宏基因组流程的分析是先将短reads组装成更长的contig，然后将这些contigs 分到不同组中，代表不同的分类群，contigs的bins有助于构建组装的宏基因组，代表部分生物完整的基因组。
最新的contig-binning方法主要有两类
基于reference的，通过与参考序列进行比较，对带有已知分类组特征的 contig 进行分类，
不基于reference的，将contig根据它们的genomic特征，聚类到未知标签的bins中，
之前是基于reference的，但由于reference可能不完整或者质量低，而且之前未识别的微生物参考基因组可能不可靠，因此，不基于reference的越来越多，并且它们可以不依赖参考数据库识别新物种。
不基于reference的主要使用两个特征去bin（分箱）
组成：以 k-mer 的归一化频率获得
覆盖深度，比对到contig每个碱基的read的平均覆盖深度，这些工具通过结合这两个信息，提升了性能。
最新的Vamb、LRbinner、RepBin采用机器学习去获取种类序列的信号到低纬特征，促进聚类。然而准确重建相似组成和覆盖深度的仍具挑战。
估计样本中的样本数量是宏基因组中的另外的一个挑战，最近的binning 工具采用single-copy marker gene （在基因组中只出现一次，并且出现在大多数细菌基因组中）估计种类的数量。MaxBin ，MaxBin2 and SolidBin 用到了这个信息，但他们只有了一个marker，所以值得探索如何用多个marker获取一个更好的bins数量的估计结果，获取过呢更多的contig的特征提升bin
Special assemblers known as metagenomic ，大多数组装工具使用 assembly graph作为主要的结构，简化DBG图获的contig。metaSPAdes 输出的contig中带有连接信息，但现有的bins工具忽略了contig中有效的连接信息。
最近的bin-refinement工具。GraphBin，GraphBin2，METAMVGL and GraphPlas 优化bins 结果，这些工具依靠目前的binning 工具并且不能动态的调整bins的数量。此外罪行的metabinner DAS和MetaWRAP整合和优化了多种binning方法的结果。尽管这些工具都提升了binning的性能，他们仍然需要其他现有binning工具的结果，并且有些不能动态调整bins的数量。因此值得探索一个单独的contig-bin工具，使用assembly graph信息，compositing 和 coverage 信息。
MetaCoAG 不使用reference ，binning metagenomic 的方法。
比对实验中好像没和refinement后的binning结果比较？
METHODS
Step 0: Assemble reads into contigs and construct the assembly graph
用metaSPAdes 获取contigs和assembly graph，输入到MetaCoAG。 也可以使用其他工具的产生的assembly graph 像MEGAHIT和metaFlye
Step 1: Identify contigs with single-copy marker genes
Single-copy marker gene 是特殊的marker gene 在细菌的基因组中只出现一次，并且在大多数的细菌染色体中都出现（conserverd）。用FragGeneScan 和 HMMER 识别包含 marker的contigs。如果marker的50%以上可以比对到一个contig，这个marker被认为被包含在这个contig。像MaxBin，MaxBin2 和 SolidBin，MetaCoAG使用marker识别属于不同物种的contigs，如果多个contig包含相同的marker，它们分别都属于不同的物种。
Step 2: Order single-copy marker genes and estimate the number of initial bins
包含相一个marker的contigs应该来自不同的物种，理想情况下，包含相同marker的contig数量就是样本中物种的数量，实际上组装的不完整性（fragmented)和错误，会降低包含一个marker的contig数量。
将marker按照包含它的contig的数量降序排序，这个列表称为SMG，每个marker g_i，有一个包含它的contig的集合C(g_i) ， 初始bins的数量设置为第一个SMG中第一个marker gene的contig数量。
Step 3: Bin contigs with single-copy marker genes
Step 3a: Initialize bins
第一个marker gene中，每个contig初始化为一个bin，bin的数量在binning的过程中会改变的。
Calculating composition and coverage similarities.
最常用的表征组成信息的基因组特征是核苷酸频率，使用总核苷酸数量标准化每个每个contig的核苷酸频率，获得它们的向量tetra(c)。